FRANCHESKA CAMILO

Autor: Francheska Camilo González
Noviembre 10, 2013

 

BACTERIAS COCOS GRAM-POSITIVOS


ABSTRACT

Las bacterias patógenas como Staphylococcus aureus, Streptococcus pyogenes y Streptococcus pneumoniae pertenecen al grupo de las bacterias cocos gram - positivos, que causa la enfermedad y la infección nosocomial que afecta cada vez más a los individuos sanos en la comunidad. Esta situación ha provocado que las pruebas de laboratorio clínico y microbiológico estén siendo utilizadas consecutivamente para encontrar tratamientos para cepas bacterianas resistentes y para identificar las bacterias que causan una enfermedad específica y de esta manera dar el antibiótico o el tratamiento adecuado. A través de este ejercicio de laboratorio se llevaron a cabo la prueba de la catalasa, la tinción Gram, la hemólisis, y la prueba de susceptibilidad para la bacitracina y optoquina en bacterias patógenas (Staphylococcus aureus, Streptococcus pneumoniae y Streptococcus pyogenes). Se determinó que el Staphylococcus aureus es catalasa positiva, Streptococcus pneumoniae es susceptible a la optoquina, y Streptococcus pyogenes es susceptible a bacitracina. También se determinó que Staphylococcus aureus y Streptococcus pyogenes son hemólisis beta, mientras que, Streptococcus pneumoniae es alfa hemolítico, y que las tres bacterias son gram - positivos.
 
Keywords: Staphylococcus aureus, Streptococcus pneumoniae, Streptococcus pyogenes, Laboratorio de Microbiología, pruebas de laboratorio, las bacterias cocos gram - positivos, estafilococo.
 

CONTENIDO

ABSTRACT.
LISTA DE ILUSTRATIONES
INTRODUCCION
Parte 1: ¿Que son las bacterias cocos Gram - positivos?
STAPHYLOCOCCUS
STAPHYLOCOCCUS AUREUS

Figure 1: Staphylococcus aureus
Figure 2: Cutaneous abscess located on the back and caused by Methicillin-resistant Staphylococcus aureus bacteria (MRSA).
STREPTOCOCCUS.
Figure 3: Streptococcus pneumoniae
STREPTOCOCCUS PYOGENES
Figure 4: Pharyngitis by Streptococcus pyogenes
STREPTOCOCCUS PNEUMONIAE
Figure 5: Pneumoonia-infected right lung by Streptococcus pneumoniae
Tabla 1: Enfermedades e infecciones por Staphylococcus aureus, Streptcoccus pyogenes, y Streptococcus pneumoniae  
Parte 2: Ejercicio de Laboratorio de Microbiología Médica para identificar bacterias cocos gram-positivos
Grupo de Laboratorio: Kelvin Garced  , José Noy , Francheska Camilo
BACKGROUND..
MATERIALES/METODOS .
Figure 6: Hemolysis Beta (β) for the bacteria Streptococcus pyogenes and Staphylococcus aureus in blood agar plate (Laboratory exercise: plate 3)

RESULTADOS

Table 2: Results for the Medical Microbiology Laboratory's Exercise for identify bacteria coccus gram positive   15
RECOMENDACIONES:
CONCLUSION.
REFERENCIAS.

 

LISTA DE ILUSTRATIONES

Figure 1:   Staphylococcus aureus
Figure 2: Cutaneous abscess located on the back and caused by Methicillin-resistant Staphylococcus aureus bacteria (MRSA)
Figure 3:   Streptococcus pneumoniae
Figure 4:   Pharyngitis by Streptococcus pyogenes
Figure 5:   Pneumoonia-infected right lung by Streptococcus pneumoniae
Figure 6:   Hemolysis Beta (β) for the bacteria Streptococcus pyogenes and Staphylococcus aureus in blood agar plate (Laboratory exercise: plate 3)


 

INTRODUCCION

La presencia de microorganismos tales como virus, hongos, parásitos, y bacterias patógenas provoca que sea necesario el uso de técnicas microbiológicas para la identificación de estos agentes infecciosos presentes en la orina, heces, sangre, esputo, y en otros fluidos corporales en personas con sistemas inmunes comprometidos o enfermedades relacionada con estos microorganismos. Los microbiólogos constantemente realizan pruebas inmunológicas y otros experimentos químicos, genéticos, y microbiológicos, en donde se utilizan métodos y técnicas de investigación para identificar microorganismos patógenos. El cultivo de esputo, coprocultivo, cultivo de orina, sensibilidad de quemaduras y heridas, y cultivos de sangre, son algunos ejemplos de pruebas microbiológicas. Los microbiólogos también utilizan pruebas microbiológicas como la tinción Gram, prueba de catalasa, y prueba de sensibilidad para optoquina o bacitracina, entre otros métodos experimentales de análisis para identificar una bacteria en un grupo compuesto por diferentes especies, como ejemplo, nuestro ejercicio de laboratorio, en donde hicimos una análisis utilizando estas pruebas experimentales para identificar bacterias cocos gram - positivos (Streptococcus pneumoniae, Streptococcus pyogenes y Staphylococcus aureus), que causan enfermedades e infecciones graves. [3]
 

Parte 1: ¿Que son las bacterias cocos Gram - positivos?

 
Los cocos gram - positivos son células bacterianas esféricas. Estas bacterias se caracterizan por la reacción a la tinción Gram y por la ausencia de endoesporas.[1]  Dentro de este grupo de bacterias se analizo la especie Staphylococcus aureus del genero Staphylococcus, y las especies: Streptococcus pneumoniae y Streptococcus pyogenes, del genero Streptococcus.

 

STAPHYLOCOCCUS

Los Staphylococcus,  también conocidos como estafilococos, son un género de bacterias de cocos gram - positivos, que se encuentran  habitualmente en la flora normal de la piel y en superficies mucosas. Este  grupo de bacterias que puede ser clasificado como patógenos, ya que pueden causar infecciones en la piel, tejidos blandos, huesos, y en el tracto genitourinario. Estas células tienen un patrón similar a un racimo de uvas, pero en muestras a nivel clínico, estos microorganismos pueden presentarse como células individuales, en pareja, o en cadenas cortas. En su mayoría, estas bacterias son  anaerobias facultativas (pueden crecer en ambientes aerobios o anaerobios), y son capaces de crecer en concentraciones en medios con concentraciones elevadas en sal, y en temperaturas de 18- 40°C. [1]
 

 

STAPHYLOCOCCUS AUREUS

Staphylococcus aureus es una bacteria Gram - positiva, catalasa – positiva, que está caracterizada por la presencia de una capa gruesa de peptidoglucanos, y por la ausencia de una membrana externa. Estas bacterias pueden encontrarse en la flora normal de la piel y en superficies mucosas, y se transmite de persona a persona, o por contacto con superficies contaminadas. Estas bacterias pueden subsistir en áreas secas por largos periodos de tiempo, y entre los factores de virulencia de esta bacteria están los componentes estructurales (Capsula, Capa de polisacáridos extracelulares, Peptidoglucanos, Acido teicoico, Proteína A), las toxinas (Citotoxinas, Toxinas exfoliativas(ETA, ETB), Enterotoxinas, y la Toxina 1 del síndrome del shock tóxico), y las enzimas (Coagulasa, Hialuronidasa, Fibrinolisina, Lipasas, y Nucleasas). Los factores de riesgo son la presencia de cuerpos extraños (ej: prótesis, catéter), cirugías previas, y el uso de antibióticos que inhiben la flora microbiana normal necesaria en el cuerpo humano. Staphylococcus aureus resistente a la meticilina, (SARM, “MRSA” siglas en ingles), es una bacteria que causa infecciones nosocomiales severas, e infecciones extra-hospitalarias en niños y adultos previamente sanos. [1]


Los antibióticos que deben ser utilizados para Staphylococcus aureus son: [1]


 
  • Oxacilina (u otras penicilinas resistentes a la penicilinasa)
  • Vancomicina (para las cepas que muestran resistencia a oxacilina)
  • Trimetoprim-sulfametoxazol, clindamicina, linezolida, daptomicina o quinupristina-dalfopristina (Todos los antibióticos mencionados pueden ser utilizados como antibióticos alternativos para el tratamiento de infecciones causadas por MRSA).

 

    

Figure 1: Staphylococcus aureus

Source: Samaritan Infectious Disease page.
<
http://www.samaritanid.com/staphylococcus_aureus.html> Accessed: 11/8/13.






Staphylococcus aureus resistente a la meticilina (MRSA), es un problema de gran importancia a nivel mundial, ya que esta se ha convertido en una de las causas de infección en la piel, y en casos más recientes, es la causante de infecciones invasivas en niños y adultos sanos en la comunidad.[1, 4]  En la Publicación de Investigación, "Vancomycin versus linezolid in the treatment of methicillin-resistant Staphylococcus aureus meningitis in an experimental rabbit model", se realizo una comparación de la eficacia antibacteriana de tratamientos como la vancomicina y linezolid, en un modelo experimental de conejo (MRSA) meningitis. En este estudio se indujo meningitis por inoculación intracisternal  utilizando la cepa ATCC 43300. Después de 16 horas de incubación y el desarrollo de la meningitis , el grupo de control no recibió antibiótico , el grupo experimental “vancomicina” recibió ( vancomicina 20mg/kg ) cada 12 horas , el grupo experimental “linezolid 10” recibió ( linezolid 10mg/kg ) cada 12 horas y el e grupo experimental “linezolid 20” recibió ( linezolid 20mg/kg ) cada 12 horas . Se procedió a hacer recuento de bacterias del líquido cefalorraquídeo a 16 horas de incubación y 24 horas después del tratamiento, y se encontró que a las 16 horas, el recuento de bacterias fue similar en todos los grupos experimentales, pero al final del tratamiento (24 horas), en el grupo de vancomicina se obtuvieron  2 registros más alto que en el grupo de linezolid 20 (p > 0,05), y 4 registros más altos que en el grupo linezolid 10 (p = 0,037). Obteniéndose que la respuesta bacteriológica total o parcial fuese mayor en vacomicina vs “Linezolid – 10”, pero no cuando se hizo la comparación de los resultados obtenidos por la vancomicina frente a “linezolid -20”. Por lo tanto, por este estudio de investigación se sugiere que el tratamiento “linezolid” no es estadísticamente inferior al tratamiento con la vancomicina, cuando estos fueron analizados en el tratamiento (SARM) meningitis, utilizando un modelo experimental de conejo con una dosis de linezolid 20 mg / kg, pero que el tratamiento era menor si se utilizaba una dosis de linezolid 10 mg / kg. [5]




    


Figure 2: Cutaneous abscess located on the back and caused by Methicillin-resistant Staphylococcus aureus bacteria (MRSA).

Photo credit: Gregory Moran, M.D.
Source: Centers for Disease Control and Prevention page.

Accessed: 11/8/13.



STREPTOCOCCUS

 
El género Streptococcus se compone de bacterias cocos gram - positivos, que se disponen en pares o en cadenas. En su mayoría son bacterias anaerobias facultativas, no obstante, algunas solo crecen en una atmósfera enriquecida con dióxido de carbono (CO2). Estas bacterias de crecimiento capnofílico, requieren que para poder ser aisladas se utilice un medio enriquecido con sangre o suero. Los Streptococcus pueden fermentar carbohidratos y mediante este proceso generar ácido láctico. Las especies de estreptococos son catalasa-negativos, y estos destacan como bacterias patógenas para los seres humanos. Las especies de este género se clasifican mediante los siguientes tres sistemas: 1) las propiedades serológicas: grupos de Lancefield (A - W); 2) patrones hemolíticos: hemólisis completa (beta [β]), hemólisis incompleta (alfa [α]) y ausencia de hemólisis (gamma [γ]); y 3) las propiedades bioquímicas (fisiológicas). [2]






Figure 3: Streptococcus pneumoniae

Source: International Society of Microbial Resistance page.
<
http://www.microresistance.org/amdr.cfm?CEProgramID=95&HeaderCEProgramContentID=85>
Accessed: 11/8/13.




STREPTOCOCCUS PYOGENES

 
Streptococcus pyogenes es una especie del género Streptococcus. Estas son bacterias cocos gram - positivos que se disponen en cadenas y tienen crecimiento rápido. En el interior de la pared celular de esta bacteria se encuentra el antígeno del grupo A de Lancefield y la proteínas  proteína M, que está asociada a los estreptococos virulento. Streptococcus pyogenes se transmite de persona a persona a través de gotitas respiratorias (faringitis) o a través de heridas en la piel por contacto directo con una persona infectada, y esta bacteria se identifica porque es positiva para PYR y porque es susceptible a la bacitracina, por lo cual el tratamiento general que se utiliza para los pacientes con esta bacteria es la penicilina. [2]

Las personas con mayor riesgo de desarrollar una enfermedad por Streptococcus pyogenes son: [2]


  • Niños de 5 a 15 años (faringitis)
  • Niños entre 2-5 años con falta de higiene (pioderma)
  • Pacientes con infección en tejidos blandos (síndrome de shock tóxico por estreptococos)
  • Pacientes con antecedentes de faringitis (fiebre reumática, glomerulonefritis)



    

Figure 4: Pharyngitis by Streptococcus pyogenes

Source: Grupo de Infecciosas SoMaMFYC page.
Accessed: 11/8/13.




STREPTOCOCCUS PNEUMONIAE

Streptococcus pneumoniae es una especie del género Streptococcus que está formado por las bacterias cocos gran-positivos, que tienen forma de " lanceta " y se disponen en pares (diplococos), o en cadenas cortas. Estas bacterias tienen ácido teicoico rico en Polisacárido C (fosfocolina) y una enzima autolítica en la pared celular. Los virulencia de Streptococcus pneumoniae se debe a que estas bacterias pueden colonizar la orofaringe, extenderse a tejidos estériles, incitar la respuesta inflamatoria local (ácido teicoico, fragmentos de peptidoglucano, neumolisina) y escapar de la fagocitosis. Las infecciones por Streptococcus pneumoniae se transmiten de persona a persona, y son ocasionadas por la propagación endógena desde la nasofaringe a regiones distantes (ej: pulmones, oídos, sangre, meninges y senos). La colonización es más alta en los niños pequeños, y las enfermedades causadas por este microorganismo son más comunes en los meses fríos, porque la gente se queda en casa y tienden a tener más contacto en espacios reducidos. Esta cepa bacteriana puede ser identificada porque es en la actividad de catalasa esta es catalasa-negativa, y por otras pruebas de laboratorio en las cuales se obtiene que es susceptible a la optoquina y soluble en bilis. El tratamiento general es la penicilina y métodos inmunización (vacuna  conjugada de 7 serotipos para los niños de 2 años de edad, vacuna polisacárida de 23 serotipos para adultos en riesgo de contraer enfermedades causadas por Streptococcus pneumoniae). [2, 7]

 

    

Figure 5: Pneumoonia-infected right lung by Streptococcus pneumoniae

Source: University of Michigan page. <http://sitemaker.umich.edu/mc2/pneumonia> Accessed: 11/10/13.




Tabla 1: Enfermedades e infecciones por Staphylococcus aureus, Streptcoccus pyogenes, y Streptococcus pneumoniae [1, 2]








Parte 2: Ejercicio de Laboratorio de Microbiología Médica para identificar bacterias cocos gram-positivos

 

Grupo de Laboratorio: Kelvin Garced [K - G] , José Noy [J - N] , Francheska Camilo[F - C]

Método y ejercicio de laboratorio: Livier González[L - G], William Arias[W - A]



[L - G] Profesor de Microbiología Médica en la Universidad Interamericana de Puerto Rico.

[W - A] Profesor  de Microbiología en la Universidad Interamericana de Puerto Rico.

[K - G, J - N, F - C] Estudiantes de la Universidad Interamericana de Puerto Rico.

 

BACKGROUND


El objetivo de este estudio fue identificar las bacterias cocos gram - positivos en pruebas de laboratorio (tinción Gram, pruebas de catalasa, y la susceptibilidad a la bacitracina o optoquina).

 
 

MATERIALES/METODOS [ L-G, W-A ]


Para el análisis se utilizó el procedimiento del Ejercicio práctico: Streptococcus, del Dr. Livier González.[L-G]  Las bacterias utilizadas en el experimento fueron: Staphylococcus aureus, Streptococcus pyogenes y Streptococcus pneumoniae. Para el ejercicio de laboratorio, se procedió a dividir cuatro placas de agar sangre en el centro (con un Sharpie), para preparar cultivos individuales de las bacterias cocos gram-positivos. Para las placas (3A y 4A), llevamos a cabo una simple estriado y en las placas de agar sangre (3B y 4B), hicimos un estriado confluente, para realizar en estas la prueba de susceptibilidad a la bacitracina y optoquina. Las placas de agar sangre se inocularon como sigue: Placa 3A (Streptococcus pyogenes y Staphylococcus aureus), placa de 4A (Streptococcus pneumoniae y Staphylococcus aureus), la placa 3B (Streptococcus pyogenes y Staphylococcus aureus) y la placa 4B (Streptococcus pneumoniae y Staphylococcus aureus).


Se procedió a añadir un disco de bacitracina para cada bacteria en la placa 3B, y un disco optoquina a cada bacteria en la placa 4B. Después, se procedió a incubar las cuatro placas a 37 ° C utilizando un frasco de CO2 por un periodo de 24 horas. Para este ejercicio de laboratorio, también se llevó a cabo una prueba para determinar la producción de la enzima catalasa, en la cual, procedimos a preparar tres laminillas de microscopio con una o dos gotas de 3 % de peróxido y una colonia de una de las bacterias (Staphylococcu aureus , Streptococcus pyogenes y Streptococcus pneumoniae) para cada laminilla, y de esta forma observar y analizar la producción de burbujas (O2) . En el siguiente período de laboratorio (después de incubar las placas de agar sangre durante un período de tiempo > 24 horas), se preparó la tinción Gram con cada bacteria utilizando el procedimiento de Laboratorio N º 5: la tinción Gram, por el Dr. William Arias.[W-A]  Para hacer la tinción de Gram, el procedimiento fue llevado a cabo de la siguiente manera para cada laminilla que contenía las bacterias a analizar : preparar frotis, secar este a temperatura ambiente, fijar con calor, cubrir con el colorante cristal violeta durante 1 minuto, lavar con agua durante 30 segundos , cubrir con una solución de yodo (mordante) durante 1 minuto, lavar con agua durante 30 segundos , decolorar con alcohol ( etanol al 95 % ) durante 15-30 segundos, lavar con agua durante 30 segundos, teñir con safranina (contratinte) durante 1 minuto, lavar con agua durante 30 segundo, secar dichas laminillas con papel bibuloso (“blot dry”), y observar en el microscopio utilizando el aceite de inmersión. [6]  Luego de completar nuestra práctica de laboratorio, se procedió a recopilar y analizar los resultados para la prueba de catalasa, tinción Gram, hemólisis y prueba de susceptibilidad utilizando bacitracina y optoquina.




    

Figure 6: Hemolysis Beta (β) for the bacteria Streptococcus pyogenes and Staphylococcus aureus in blood agar plate (Laboratory exercise: plate 3)
Photo credit: Kelvin Garced  , Jose Noy   Francheska Camilo
Source: Medical Microbiology Laboratory's Exercise for identify bacteria coccus gram positive.

www.FrancheskaCamilo.com





RESULTADOS

Para el ejercicio de Laboratorio de Microbiología Médica “ identificación de bacterias cocos gram-positivos”, se realizó la prueba de catalasa, hemólisis, tinción Gram y la prueba de susceptibilidad utilizando optoquina y bacitracina en muestras preparadas con bacterias de Staphylococcus aureus, Streptococcus pneumoniae y Streptococcus pyongenes. En la prueba de catalasa, se encontró que la bacteria Staphylococcus aureus son catalasa - positivos, mientras que Streptococcus pneumoniae y Streptococcus pyogenes son catalasa - negativos. Para la prueba de susceptibilidad a la bacitracina y optoquina, encontramos que Streptococcus pneumoniae es susceptible a la optoquina y Streptococcus pyogenes es susceptible a bacitracina. También en este ejercicio de laboratorio se obtuvo, que Streptococcus pyogenes y Staphylococcus aureus son hemólisis beta [β], mientras que Streptococcus pneumoniae es alfa hemolítico [α].



Table 2: Results for the Medical Microbiology Laboratory's Exercise for identify bacteria coccus gram positive









 

RECOMENDACIONES

Se requieren el uso de distintas  pruebas experimentales para identificar las bacterias que causan una enfermedad o infección. El proceso de análisis microbiológico debe ser aséptico, utilizando métodos adecuados que promuevan la protección de la piel,  para evitar el contagio o transmisión de enfermedades causadas por estas bacterias oportunistas. En el laboratorio, las pruebas deben realizarse más de una vez para obtener resultados fiables.





CONCLUSION

 
Staphylococcus aureus, Streptococcus pyogenes y Streptococcus pneumoniae, son bacterias cocos gram – positivos, que tienen una gran importancia para la industria clínica y microbiológica, ya que estas bacterias se consideran patógenas y causan un gran número de enfermedades e infecciones nosocomiales o en individuos sanos en la comunidad. Staphylococcus aureus es una bacteria que se encuentra en la flora de la piel y en la superficie de las mucosas, y esta es una bacteria que muestra resistencia a la penicilina y puede causar impétigo, y otras infecciones supurativas más graves, tales como bacteriemia, lo que provoca la difusión de bacterias en la sangre, y endocarditis, la cual es una enfermedad que provoca daños a el revestimiento endotelial del corazón. Streptococcus pyogenes es una bacteria importante en el área de investigación , ya que se transmite fácilmente de persona a persona a través de gotitas respiratorias o en las heridas de la piel por contacto con la persona infectada, y esta bacteria es la causante de infecciones o enfermedades como la faringitis y la fiebre reumática. Streptococcus pneumoniae, es una bacteria que causa neumonía, la cual es una enfermedad en donde el paciente puede desarrollar una infección pulmonar. En este estudio microbiológico se realizó la prueba de catalasa, hemólisis, tinción Gram y prueba de susceptibilidad a la bacitracina y optoquina. Mediante estas pruebas de laboratorio se obtuvo que el Staphylococcus aureus es catalasa positiva, Streptococcus pneumoniae es susceptible a la optoquina y Streptococcus pyogenes es susceptible a bacitracina. Además, cuando se cultivaron estas bacterias en agar sangre, se determinó que Streptococcus pneumoniae es alfa - hemolítico, mientras que Streptococcys pyogenes y Staphylococcus aureus poseen una hemolisis completa (Hemolisis Beta). Por lo tanto, al analizar los resultados, se determinó que es necesario realizar varias pruebas para la identificación exacta de una bacteria causante de enfermedad o infección, y de esta forma ser capaz de asignar un tratamiento eficaz. Se concluye, que tal como en obtuvimos en nuestro ejercicio de laboratorio, es necesario utilizar distintos métodos experimentales, ya sea para diferenciar distintos géneros (Staphylococcus y Streptococcus), o para identificar distintas especies en un genero bacteriano (Streptococcus pyogenes y Streptococcus pneumoniae), y pues cada bacteria puede o no reaccionar igual a una misma prueba, lo que hace necesario realizar varias para confirmar la presencia de una bacteria con exactitud.








REFERENCIAS

 
  1. Murray, P. & Rosenthal, K. & Pfaller, M. (2009). Microbiología Medica.209-223p.Staphylococcus y cocos grampositivos relacionados. ISBN 978-84-8086-465-7.

  2. Murray, P. & Rosenthal, K. & Pfaller, M. (2009). Microbiología Medica.224-242p.Streptococcus. ISBN 978-84-8086-465-7.

  3. Facultas Ciencias de la Salud, Universidad del Cauca. Cocos Gram Positivos. <www.facultadsalud.unicauca.edu.co/Documentos2010/DptoMedInt/Cocos_gram_positivos.pdf> Disponible: Noviembre 10, 2013

  4. Gorwitz R, Jernigan D, Powers J, Jernigan J and Participants in the Centers for Disease Control and Prevention-Convened Experts’ Meeting on Management of MRSA in the Community. (2006). Strategies for Clinical Management of MRSA in the Community: Summary of an Experts’ Meeting Convened by the Centers for Disease Control and Prevention.
    <
    http://www.colorado.gov/cs/Satellite?blobcol=urldata&blobheadername1=Content-Disposition&blobheadername2=Content-Type&blobheadervalue1=inline%3B+filename%3D%22Clinical+Management+of+MRSA+in+the+Community+(CDC+website).pdf%22&blobheadervalue2=application%2Fpdf&blobkey=id&blobtable=MungoBlobs&blobwhere=1251811742663 >

         Disponible: Noviembre 10, 2013

  1. Calik S, Turhan T, Yurtseven T, Sipahi OR, Buke C. Vancomycin versus linezolid in the treatment of methicillin-resistant Staphylococcus aureus meningitis in an experimental rabbit model. Med Sci Monit. 2012; 18(11): SC5–SC8.

  2. Amador, C. Laboratorio No. 5: tinción Gram, del Dr. William Arias. <http://www.studyblue.com/#file/view/4596192  >

         Disponible: Noviembre 10, 2013

  1. NIH (National Institutes of Health). Neumonía.
    <
    http://www.nlm.nih.gov/medlineplus/spanish/pneumonia.html >

         Disponible: Noviembre 10, 2013